上海秉（bǐng）越電子儀器有限公司

產品采（cǎi）集與樣品處理

於同一批（pī） 號的 二個（gè）運輸包（bāo）裝中至少抽（chōu）取 12個蕞小銷售包裝樣品，1/4樣品用於檢測，1/4樣品（pǐn）用於留樣，另 1/2樣品（可就地封存）必（bì）要時用於複檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應有破裂，檢驗前不（bú）得啟開。

在100級淨化條件下（xià）用無菌方法打開用於檢測的至少 3個包裝，從每（měi）個包裝中取（qǔ）樣，準確（què）稱取10g±1g樣品（pǐn）。剪碎後加人到200ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個生理鹽水樣液。液體產品用原液直接做（zuò）樣液。

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導（dǎo）致不能吸出足夠樣液時，稀釋液量可按每次 50ml遞增，直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與（yǔ）真菌菌落總數時（shí）相應調整稀釋度。

B2  細菌菌（jun1）落總數與初始汙染（rǎn）菌檢測方法

本方法適用於產品初始汙染菌與（yǔ）細菌菌落總數（以下統稱為細菌菌落總數）檢測。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降後（hòu）取上清液作菌落計（jì）數。共接種 5個平皿，每（měi）個平皿中加人 1ml樣液，然後用冷卻至45℃左右的熔化的營養瓊脂培養基（jī） 15～20ml倒（dǎo）人每個（gè）平皿內混合（hé）均勻 。待瓊脂凝固後翻轉平皿置 35℃±2℃培養 48h後，計算平板上的菌（jun1）落數。

B2.2 結果報告

菌落（luò）呈（chéng）片（piàn）狀生長的平板不宜采用（yòng）；計數符合（hé）要求的平板上的菌落（luò），按式（B1）計算結果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–細菌菌落總數 cfu/g或cfu/mL；

A——5塊營養瓊（qióng）脂培養（yǎng）基平板上的細菌菌落總數；

K——稀釋度。

當菌落數在 100以內，按實有數報告，大於 100時（shí）采用二位有效數字。

如果（guǒ）樣品菌落總數超過本標準的規定，按 B2.3進行複檢和（hé）結果報告。

B2.3 複檢方法

將留存的複檢樣品依（yī）前法（fǎ）複測 2次，2次結果平均值都達到本標準的規定，則判定被（bèi）檢樣品合（hé）格；其中有任何 1次結果平均值超過本標準規定，則判定被檢樣品不合格。

B3  大腸菌（jun1）群檢測方法

B3.1 操作（zuò）步驟

取樣液 5ml接種 50ml，乳糖膽鹽發酵管，置 35℃±2℃培養 24h，如不產酸也不產氣，則報告為大腸菌群陰性。

如產酸產氣，則劃線接種伊紅美（měi）藍瓊脂平板，置35℃±2℃培養 18～24h，觀察（chá）平板上菌落形態。典型的大腸（cháng）菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整（zhěng）齊（qí），表麵光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略（luè）帶（dài）金（jīn）屬光（guāng）澤，或粉紅色，中心（xīn）較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個作革蘭氏（shì）染（rǎn）色鏡檢（jiǎn），同時接（jiē）種（zhǒng）乳糖發醉管，置 35℃±2℃培養（yǎng） 24h，觀察產氣情況（kuàng）。

B3.2 結果報告（gào）

凡乳糖膽鹽發（fā）酵骨產酸產氣（qì），乳糖發（fā）酵管產酸產氣，在伊紅（hóng）美藍平板上（shàng）有典型大腸（cháng）菌（jun1）落，革蘭（lán）氏染（rǎn）色為陰性無芽胞杆菌，可（kě）報告被檢樣品檢出大腸杆菌。

B4  綠膿杆菌檢測方法

B4.1 操作步驟

取樣（yàng）液 5ml，加人到（dào）50ml SCDLP培（péi）養液中，充分混勻，置 35℃±2℃培養 18～24h。如有綠膿杆菌生長，培養液農麵呈現（xiàn）一層（céng）薄菌膜，培養液常呈黃綠（lǜ）色或藍綠色。從培養液的薄菌膜處挑（tiāo）取培養（yǎng）物，劃線（xiàn）接種十六烷三甲（jiǎ）基溴化胺瓊脂平板，置 35℃±2℃ 培養 18～24h，觀（guān）察菌落特征。綠膿杆菌在此培養（yǎng）基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落（luò）周圍培養基略帶粉紅色，其他菌不長。

取可（kě）疑菌落塗（tú）片作（zuò）革蘭氏染色（sè），鏡檢為革蘭氏陰性菌者應進行下列試驗：

氧化酶試驗：取（qǔ）一小塊潔淨的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻棒挑取可疑菌落塗在濾紙片上，然後在其上（shàng）滴加一（yī）滴新配製的 1%二甲基對苯二胺試液，30s內出現粉紅（hóng）色或紫紅色，為氧化酶（méi）試驗陽性，不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗：取2-3個可（kě）疑菌（jun1）落（luò），分別接種在綠膿菌素測定用培養（yǎng）基斜麵，35℃±2℃培（péi）養24h，加入 3～5ml，充分振蕩使培養物（wù）中可能存在的綠（lǜ）膿菌素溶解，待三（sān）-氯-甲-烷呈藍（lán）色（sè）時，用吸管移到另一試管中並加人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩後靜置片刻。如上層出現粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。

硝酸鹽還原產氣試驗：挑取被檢菌落純（chún）培養物接種在硝酸鹽（yán）脈水培養基中，置 35C12C培養24h培（péi）養基小倒管中有氣（qì）者（zhě）即為陽性

明膠液化試驗:取可疑菌落純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置 35℃±2℃培養 24h，取出放於4～10C，如仍呈（chéng）液態為陽性，凝固者為陰性。

42℃生長試驗：取可（kě）疑培養物，接種在普通瓊脂斜麵培（péi）養基上，置 42℃培養 24～48h，有綠膿杆菌生長為陽性。

B4.2 結果報告

被檢（jiǎn）樣品經增菌分離培養後，證實為革蘭氏陰性杆菌，氧化酶及（jí）綠膿杆菌試驗均為陽性者，即可報告被檢樣品（pǐn）中檢出（chū）綠膿杆菌 如綠膿（nóng）菌素試驗陰（yīn）性而液化（huà）明（míng）膠、硝（xiāo）酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿杆（gǎn）菌。

B5 金黃（huáng）色葡萄球菌（jun1）檢（jiǎn）測方法

B5.1 操作步驟

取樣液 5ml，加入到 50mL SCDLP培養液中（zhōng），充分混勻（yún），置 35℃±2℃培養 24h，自上述增菌液中取1～2接種環，劃線接種在血瓊脂培養基上（shàng），置 35℃±2℃培（péi）養24～48h。在血瓊（qióng）脂平（píng）板上該菌菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表（biǎo）麵光滑，周圍有溶血圈。

挑取典型菌落，塗片（piàn）作革蘭（lán）氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜。鏡檢符合 上述情況，應（yīng）進行下列試驗：

甘露醇發酵試驗：取上述菌（jun1）落接種甘露醇培養液，置 35℃±2℃培養 24h，發酵甘露醇產酸者為陽（yáng）性（xìng）。

血漿凝固酶試驗：（1）玻片（piàn）法：取（qǔ）清潔幹燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一（yī）滴兔血漿，挑:取菌落分別與生理鹽水和血漿混合（hé），5min如血漿內出現團塊或顆（kē）粒狀（zhuàng）凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固（gù）則為陽性，如（rú）兩者均無凝固（gù）則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有（yǒu）凝固現象，再進行試管凝固酶試驗；（2）試管法：吸取 1：4新鮮血漿 0.5ml，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌 24h肉湯（tāng）培養物 0.55mL，混勻，放 35℃±2℃溫（wēn）箱或（huò）水浴中（zhōng），每半小時觀察一次，24h之內呈現凝塊即為陽性（xìng）。同時以已知（zhī）血漿凝固（gù）酶陽性和陰性菌株（zhū）肉湯培養物各0.5ml，作為陽性與陰性對照。

B5.2 結果報告

凡在瓊脂（zhī）平板上有可疑菌落生長，鏡（jìng）檢為革蘭氏陽性葡萄球菌（jun1），並能（néng）發酵甘露（lù）醇產酸，血（xuè）漿凝固（gù）酶試驗陽性者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡（pú）萄球菌。

B6 溶血（xuè）性鏈球菌檢測方法

B6.1 操作步驟

取樣液 5ml加人到 50ml葡萄糖肉湯（tāng）， 35℃±2℃培養 24h，將培養物劃線（xiàn）接種血瓊（qióng）脂平板， 35℃±2℃培養24h觀察菌落特（tè）征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰自色，半（bàn）透（tòu）明或不透明（míng），針尖狀突起，表麵光滑，邊（biān）緣整齊，周圍有無色透明溶血圈。

挑取典型菌落作塗片革蘭氏染色鏡（jìng）檢（jiǎn），應為革（gé）蘭氏陽性（xìng），呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況，應進行下（xià）列試驗（yàn）：

鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿 0.2ml（0.01g草酸鉀加5mL兔血（xuè）漿（jiāng）混勻，經離心沉澱，吸取上清液），加人 0.8ml滅（miè）菌生理鹽水，混勻後再加人待檢菌（jun1） 24h肉湯培養物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml，混勻，放 35℃±2℃水浴中，2min觀（guān）察一次（一般10min內可凝固），待血（xuè）漿凝固後繼續觀察並記錄溶化時間（jiān）。如 2h內不（bú）溶化，繼續放置 24h觀察，如凝塊全（quán）部溶化為陽性（xìng），24h仍不溶化為陰性。

杆菌膚敏感試驗：將（jiāng）被檢菌（jun1）菌液（yè）塗（tú）於血平板上（shàng），用滅菌鑷子取每片含 0.04單位杆菌膚的紙片放在平（píng）板表麵仁，同時以已知陽性菌株作對照，在 35℃±2℃下（xià）放置 18～24h，有抑菌帶者（zhě）為陽性。

B6.2 結果報告

鏡檢革蘭氏陽性鏈狀排列球菌，血（xuè）平板上呈現溶血圈（quān），鏈激酶和杆菌膚試驗陽性，可報告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。

B7 真菌菌落總數檢測方法

B7.1 操作步驟

待上述生理（lǐ）鹽水樣液自然（rán）沉降後取上清（qīng）液作真菌計（jì）數。共接種5個平皿（mǐn），每個（gè）平皿（mǐn）中加人（rén） 1ml樣液，然後用冷卻至 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養基 15 ～25mL倒（dǎo）人每個平皿內混合均勻，瓊脂凝固後翻轉平皿置 25℃±2℃培養 7天，分別於 3，5，7天觀察，計算平板上（shàng）的菌落（luò）數，如果發現菌（jun1）落（luò）蔓延，以（yǐ）前 一次的菌落計數為準。

B7.2 結（jié）果報告

菌落（luò）呈片狀（zhuàng）生長的平板不宜采用；計數符合要求的平板上的菌落，按式（B2）計算結（jié）果：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌菌落總數，cfu/g或cfu/mL；

B—–5塊沙氏瓊脂培養基平板上的真菌（jun1）菌落（luò）總數;

K—–稀釋度。

當菌落數在 100以內，按實有數（shù）報告，大於 100時采用（yòng）二位有效數字。

如果（guǒ）樣品菌（jun1）落總數超過本標準的規定，按 B7.3進行複檢和結果報告。

B7.3 複檢方法（fǎ）

將留存（cún）的複檢樣品依前法複測 2次（cì），2次結果都達到本標準的規定，則判定被檢樣品（pǐn）合格；其中有任何 1次結果超過本（běn）標準規定（dìng），則判定被檢樣品不合（hé）格。

B8 真菌定性檢測方法

B8.1 操作步驟

取樣液 5mL加入到50mL沙氏培養基中， 25℃±2℃培養 7天，逐日觀察有無真菌生長。 

B8.2 結果報告

培養管混濁應轉種沙氏瓊脂培養基，證（zhèng）實有真菌生長，可報告被檢樣品檢出（chū）真菌。