上海秉（bǐng）越電子儀器有（yǒu）限公司

OOS(outofspecification,超限度（dù）、超規格)結果，是（shì）指產品質量指標測試中超出已經建立的可接受標準的單個或一係列結果（guǒ）。無菌產品的陽性結果、微生物限（xiàn）度試驗超出行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標準等（děng）均為OOS結果《中國藥典》2015年版m和新版《藥品生產（chǎn）質量管理規範》（GMP)增加了OOS調查章節，對（duì）微（wēi）生物實驗室00S結果的調查做出了較為詳細的（de）闡（chǎn）述和實例分析，要求任何（hé）OOS結果必須按照書麵規程進行完整的調查。因為（wéi）隻有確定了OOS結果產生的原因並（bìng）判定其是否有效，進（jìn）而才能製訂完善的預防和整改措施，以保證檢驗結果的準確性。因此，實驗室建立OOS調查處理程序，對OOS結果進（jìn）行科學（xué）、及時、有效的調查（chá）分（fèn）析處理是十分必要的微生物在自然環境中無處（chù）不在，並可能會隨檢驗人（rén）員、檢（jiǎn）驗用器材以及檢品的包裝容器（qì）進入檢驗環境。因（yīn）此（cǐ），關於微生物檢驗中藥品的無菌檢査項目，新版藥典對其（qí）操作環境（jìng）提（tí）出了更高要求，新版GMP也加強了對無菌操作（zuò）環境空氣微生物、表（biǎo）麵微（wēi）生（shēng）物以（yǐ）及人員手（shǒu）套和操作服表麵微生物的監（jiān）測頻率，並做出（chū）了明確規定。而（ér）對於無菌（jun1）檢査OOS結果的調査，需核實的相關記錄和影響因素更為繁雜。基於它的複雜性（xìng），OOS結果的調查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於它的變異性，調（diào）查過程又需針對不同的OOS結果（guǒ）著重分析調查相應的不同環節。
對於微生（shēng）物實驗（yàn）室OOS的調查，局限於每個檢驗單位的技術水平和資源，同樣限於人類對微生物掌握的（de）局限，不是每次的OOS調査都（dōu）可（kě）以發現其根本原因，但通過此調査過程仍能（néng）夠幫助調查者找出（chū）超標結果發生的可能原（yuán）因並進（jìn）而采取糾正預防措施，基於風（fēng）險分析，對相關（guān）批次產品做出最後處理決定'從而降（jiàng）低藥品質量風險，既是保證藥品質量的重要（yào）工作，又是質量（liàng）體係持續改進的原動力。本文通（tōng）過對4批無菌產品的無菌檢査實驗（yàn）全過程的回顧性分析和調查，探索導致無菌（jun1）實驗OOS結果的（de）明確原因，以期建（jiàn）立微生物實驗室完善的OOS調査方案。
1、材（cái）料、儀器與試劑（jì）
全自動智能無菌集菌（jun1）儀(上海秉越zw-2008)一次性使用（yòng）全封閉集菌培（péi）養（yǎng）器顯微鏡AxiosescopeA
全自動微生物鑒定儀
酵母菌鑒定卡
無菌（jun1）檢查樣品為4個（gè）批（pī）號的注射用頭孢噻（sāi）膀鈉。
2、方法與結果
2.1實（shí）驗方法
 
2.1.1藥品的無（wú）菌檢查
依照《中國（guó）藥（yào）典》2010年版_檢驗注射用頭孢噻肟鈉的無菌檢查（chá）項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽（yáng）性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按照儀器及（jí）試劑的使用說明，對經過（guò）純化的（de）微生（shēng）物（wù）進行革蘭氏染色，確定微生物（wù）形態，然後根據形態選擇鑒定（dìng）卡，使（shǐ）用全自動微生（shēng）物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號的（de）注射用頭孢噻（sāi）肟鈉的無菌檢查檢驗結果如表1所示：2號和4號樣品改良馬丁培養基均在第3天變渾濁。取（qǔ）改良馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板上呈現白色、光滑、邊緣整（zhěng）齊（qí）、形態單一的菌落。
革蘭氏染色鏡檢結果為（wéi）酵母（mǔ）菌。經全自動微（wēi）生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假絲酵母。
 
3、OOS結果的調查和（hé）分析
依據新版GMP對OOS調查的要求，回顧性分析（xī）調查注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結果產生的原因。
 
①日常（cháng）監控和驗收記錄：
培養基的（de）驗收記錄、培養基的製備和滅菌記（jì）錄、檢驗器具準備和（hé）滅菌記（jì）錄、消毒液配置和無（wú）菌過濾記錄、潔淨室清潔消毒記錄、檢驗員（yuán）使用潔淨服的滅（miè）菌記錄和使用記錄、無菌檢驗操作記（jì）錄以及環境監控記錄（lù）等均未發現異常。
②人員：
甲和乙實驗人員均能熟練掌握無菌（jun1）檢（jiǎn）驗的流程、監控要點和無菌操作規範。
③樣品：
確（què）認樣品的編號和批號無（wú）誤，無菌檢査取樣前，樣品西林瓶外觀正常，西（xī）林瓶蓋並未發現（xiàn）鬆動的跡（jì）象。
④實驗器具：
實驗中使用的（de）py330集菌器、一次件使用無菌注射器以及一次性使用無菌手套的（de）無菌驗收均符合（hé）規（guī）定，且用於（yú）當（dāng）天其（qí）他檢品的檢驗，並未發現汙染情況。
⑤培養基及衝洗液和稀釋液：
無（wú）菌檢查用培養基的陰性對照（zhào）均符合規定，且同批製備和滅菌的培養基用於同日檢（jiǎn）查的其他檢品，並未發（fā）現汙染（rǎn）情（qíng）況。
⑥檢驗環（huán）境：
現場（chǎng）環境監控的3皿（mǐn）沉降菌監測的TSA平皿均未有菌落生長，並未出現汙染情況。定期環（huán）境檢測表麵菌符合規定，樣品無菌檢查當日潔淨空調係統均運行正常。
⑦不同檢驗（yàn）體係對結果判（pàn）定造成的影響：
由於現行《中國藥典（diǎn）》無菌檢（jiǎn）查使用（yòng）的改良馬丁培養基不同於（yú）國際標準使用的TSB,將改（gǎi）良（liáng）馬丁培養物劃線TSA平板上長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後（hòu）培養（yǎng）液即（jí）出現（xiàn）混濁現象。因此可以排除因檢驗體係不同造成的實驗結果（guǒ）偏差。
⑧菌株：
樣品檢出菌經鑒定為季也蒙假絲酵（jiào）母菌，比（bǐ）對曰常潔淨室（shì）監控收集的菌株（zhū）建（jiàn）立的菌庫，潔淨室中從未監測到此種菌株。
⑨附加實驗的結（jié）果與分析：
通過以上分析，初步認定無菌不合格（gé）為實驗有效（xiào）結果。但（dàn）鑒於此次無菌檢驗過程並未嚴格（gé）按照新版GMP和《中國藥典》2015年版規定的對檢驗環境和人員的全麵監控，環境和人員帶來的汙染仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就（jiù）是對檢驗環境進（jìn）行（háng）全麵（miàn）監測。
現場環境監控按照新版GMP的要求實施，並增加對潔淨室回風（fēng）口浮遊菌的監測，監測（cè）結果均符合規定。微生物監測方麵，除實驗人員無菌服胸口處采集到一個菌落，其他均未有菌落（luò）生長。實驗人員無菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經（jīng）鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種（zhǒng）曾在日常潔淨室監控中不止一次檢（jiǎn）出過，並未對樣品產生過汙染（rǎn）。
4、結論與討論
OOS結果表明，並未（wèi）在實驗室發現導（dǎo）致OOS結果的明（míng）確原因，檢出菌（jun1）也並非由（yóu）於實驗室檢驗過程帶（dài）來的汙染，懷疑樣品本身被季也蒙假絲酵（jiào）母菌所汙染，從（cóng）而導致無菌檢查的陽性結果。
通（tōng）過對上述OOS的調查和分析，初步建立了微生物實驗室OOS結果調查的分析方案，分（fèn）別從（cóng）人、機、料（liào）、法、環5個方麵進（jìn）行闡述：
人——實驗人員。考察人員是否經過（guò）相關檢驗的培訓和考核（hé），是否了解該項檢驗的流程和監控要點。無菌（jun1）區（qū）全體人員每年應進行一次再培訓和資格的再確認（rèn），對無菌區人員操（cāo）作服和手套表麵的微生物監測嚴格（gé）按新版GMP執行（háng）；
機——實（shí）驗中使（shǐ）用的儀器設備。檢查集（jí）菌儀等儀器近期使（shǐ）用記錄是否發現異（yì）常，參數設置是（shì）否正確。儀器的計量和校（xiào）準均需（xū）在有效期內，無菌區內使用的儀器需定期消毒並定期（qī）進行微生物（wù）的表麵監（jiān）測，使用（yòng）的器具需經滅菌消毒，一次性使（shǐ）用（yòng）器（qì）具需經質（zhì）量驗收；
料——樣品、培養基、稀（xī）釋液和衝洗液。檢（jiǎn）查剩餘樣品（pǐn）的編號和批號是否準確，樣品（pǐn）的外觀是否異常，瓶蓋是否有鬆脫現象以及樣品的前（qián）期存放條件和取樣方式是否合理。必要時，對樣品的瓶蓋和瓶口等關鍵（jiàn）部（bù）位擦（cā）抹取樣，培養觀察；
檢查培養基質量驗（yàn）收記（jì）錄和配製記錄，確認配製和滅菌是否合理有效，是否用於其他樣品（pǐn）的檢驗（yàn），培養基、稀釋液和衝洗（xǐ）液的陰性對照應符合規定；
法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設定實驗和檢驗（yàn）依據的要求；
環——實驗環境。檢查潔（jié）淨空調係統是否（fǒu）運行正常，監測記錄包括定期監控記錄和實驗現場環境監控記（jì）錄，是否符合（hé）潔淨度要求，清（qīng）潔記錄顯示是否按時清潔，消（xiāo）毒液是否使用合（hé）理（lǐ）。另外，未（wèi）確定OOS結果產生的明確原因時，不能急於對環境進行消毒（dú）處理，以免忽略（luè）了可能（néng）的（de）環境汙染因素。
 
微生物負荷和實驗檢出菌的比對分析。實（shí）驗室的微生物負荷，包括潔淨（jìng）室（shì）的空氣微生物、表麵微生物和人員操（cāo）作服（fú）及手套的表（biǎo）麵（miàn）微生物（wù）。對日常環境監控（kòng）收集的菌株進行有效鑒別和分析，建立潔淨（jìng）室生物負載數據庫，可為微生物OOS調査提供數據基礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分析監控收集的微生物（wù）分布和鑒定與陽性結果的相關性（xìng），當發現與陽性（xìng）菌株相近的菌株時，可（kě）利（lì）用分子生物學方法比對陽性菌株與微生物負荷的同源性，為陽性菌的汙（wū）染溯源提供依（yī）據。
此外，對不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相關環節靈活考察。例如，針對不同的微生物（wù），采用不同的監測手段，陽性檢出菌（jun1）為酵母菌時，增加沙氏葡萄糖瓊脂用於環境監控的附加實驗，則能夠更好（hǎo）地確認環境中的（de）該類微生（shēng）物。
需要著重強調的是，檢出（chū）菌的鑒別對於OOS結果的調（diào）查非常關鍵，決定（dìng）最後是否可以發現根本原因，應該（gāi）給（gěi）予足夠（gòu）重視（shì）。
綜上所述，微生物相（xiàng）關檢（jiǎn）驗項目OOS結果的調查工作量很大，且專業性強（qiáng），實驗室不僅需要具（jù）備受過良好培訓和具有豐富檢驗經驗的工（gōng）作人員，還需建立完善的OOS調查方案來規範調查操作。