附錄Ⅻ A 無菌檢查法（fǎ）
無菌檢查法係用於檢查藥典要求無菌的生物（wù）製品、醫療（liáo）器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若（ruò）供試品符合無菌檢查法的規定（dìng）,僅表明了（le）供試品在該檢驗條件下未發現微生物汙染。
無菌檢查應在環境潔淨度 10 000 級（jí）下的局部潔淨（jìng）度 100 級的單向流空（kōng）氣區（qū）域內或隔離係統中進行，其全過（guò）程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物汙染（rǎn），防止汙染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作台麵及環境應（yīng）定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮遊菌（jun1）和沉降菌的測試方（fāng）法》的現（xiàn）行國家標準進行潔淨度驗證。隔離係統應按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔淨度須符合無菌檢查的要求。日常（cháng）檢驗還需對試驗環境進行（háng）監控。
無（wú）菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培（péi）訓。
培養基
培養基的製備
培養基可按以下處方製備，亦可使用按該處方生（shēng）產的符（fú）合（hé）規定的脫水培養基。配製後應（yīng）采用驗（yàn）證合格的滅菌程（chéng）序（xù）滅菌。製（zhì）備好的培養基應保存在 2℃～ 25℃、避光的環境，若保存於非密（mì）閉容器中，一般在三周內使用；若保存（cún）於密閉容器中，一般可在一年內使用。
1. 硫乙（yǐ）醇酸鹽（yán）流體培養基
酪腖 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5g
L-胱氨酸 0.5g 新配製（zhì）的 0.1% 刃天（tiān）青溶液 1.0 ml
硫乙（yǐ）醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫（liú）乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml
除（chú）葡萄糖和刃天青溶液外，取上（shàng）述成分混合，微溫（wēn）溶解，調節（jiē） pH 為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液（yè），搖勻，調節 pH 值使滅菌後為 7.1 ± 0.2 。分裝（zhuāng）至適宜的容器中，其裝量與（yǔ）容器高度的比例應（yīng）符合（hé）培養結束後培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的 1/2 ，滅菌。在供試品接種前（qián），培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的 1/5 ，否則，須經 100 ℃水浴加熱（rè）至粉紅色消失（shī）（不超過 20 分鍾），迅速冷卻（què），隻限加熱一次，並防止被汙染。
2.改良馬丁培養基
腖 5.0g 磷酸（suān）氫二鉀（jiǎ） 1.0g
酵母浸出粉（fěn） 2.0g 硫酸鎂 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外（wài），取上（shàng）述成分混合，微溫溶解，調節 pH 值約（yuē）為 6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節 pH 值使滅菌後為 6.4 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
3.選擇性培養基
按上述硫乙醇酸鹽（yán）流體培養基或改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用（yòng）前（qián）加入適宜（yí）的中（zhōng）和劑、滅活劑或表麵活性劑，其用量（liàng）同驗證試驗。
4.營養肉湯培養基
腖 10.0g 氯化（huà）鈉（nà） 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微溫溶解，調節 pH 為弱堿性，煮（zhǔ）沸，濾清，調節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
5. 營養瓊脂培養（yǎng）基
按上述（shù）營養肉湯培養基的處方及製（zhì）法（fǎ），加入 14.0g瓊脂，調節 pH 值（zhí）使滅菌後為（wéi） 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅（miè）菌（jun1）。
6. 改良馬丁瓊（qióng）脂培養基
按改良馬丁培養基的（de）處方及製法（fǎ），加入 14.0g瓊脂，調節 pH值使滅菌後為 6.4 ± 0.2，分裝，滅菌。
培養基（jī）的適用性檢（jiǎn）查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基（jī）及改良馬丁培養基應符（fú）合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的（de）要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試（shì）品的（de）無菌（jun1）檢查同時進行。
無菌性（xìng）檢查 每批培養基隨機抽取不少於 10 支（瓶），5支（zhī）（瓶）置30℃～35℃另5支（瓶）置20℃～25℃培養 14 天，均應無菌（jun1）生長.
靈敏度（dù）檢查
菌種：培養基靈敏度檢（jiǎn）查（chá）所用的菌株傳代次數不得超過 5 代（從菌種保存中心（xīn）獲得的冷凍幹燥菌種為第 0 代），試驗用菌種應采用適宜的（de）菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠假單（dān）胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢（bāo）杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲黴( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液製備 接種（zhǒng）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（jun1）、枯草芽孢杆菌的新（xīn）鮮培養物至營養肉湯（tāng）培養基中或（huò）營養瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的（de）新鮮培養物至（zhì）硫乙醇酸（suān）鹽流體培養基中，30℃～35℃培養（yǎng）18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，20℃～25℃培養24小時～48小時，上（shàng）述培（péi）養物用 0.9%氯化鈉溶液製成每1ml含菌數小於 100 cfu（菌落形（xíng）成單位）的菌懸液。接種黑曲黴的（de）新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23℃～28℃培養 5天～7天（tiān），加入 3ml～5ml 無菌的含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的0.9%氯化鈉溶（róng）液，將孢子洗脫。然後，用適宜的方法吸出孢（bāo）子懸液至（zhì）無菌試管內，用無菌的含 0.05％（v/v）聚山梨（lí）酯 80的0.9%氯（lǜ）化鈉溶液製成每 1ml含孢子數小於100 cfu的孢子懸液（yè）。
菌懸液在（zài）室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2℃～8℃可在24小時內使用。 黑（hēi）曲黴孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗證過的貯（zhù）存（cún）期內使用。
培養基接種 取（qǔ）每管（guǎn）裝量為 12ml的硫（liú）乙醇酸鹽流體培（péi）養基 9支，分別接種小於100 cfu的金黃色葡萄（táo）球（qiú）菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各 2支，另（lìng） 1支不接種作為空（kōng）白對照，置30℃～35℃培養3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基5支,分別接種小（xiǎo）於 100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各 2支，另（lìng） 1支不接種作（zuò）為空白對照，置（zhì）20℃～25℃培養5天。逐日觀察結果。
結果判定 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長（zhǎng）良好，判該培養（yǎng）基的靈敏度檢查符（fú）合規定。
稀釋液、衝洗液及其製備方（fāng）法
稀釋液、衝洗液配製後應采用驗（yàn）證合格的（de）滅菌程序滅菌。
1. 0.1%蛋白腖水溶液 取蛋白腖 1.0g，加水 1000ml，微（wēi）溫（wēn）溶解，濾清（qīng），調節 pH值至 7.1±0.2，分裝，滅菌。
2. pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液 取磷酸二氫鉀 3.56g ，磷酸氫二鈉 7.23g，氯化鈉4.30g，蛋（dàn）白腖（dòng） 1.0g，加（jiā）水 1000ml ，微溫（wēn）溶解（jiě），濾清，分裝，滅菌。
3. 0.9%氯化鈉溶液 取（qǔ）氯化鈉9.0g，加水溶解（jiě）使成1000ml，過濾（lǜ），分裝，滅菌(僅用於上述兩種溶液不適（shì）用時使用)。
4. 根據（jù）供試品的特性，可選用其他經（jīng）驗證過（guò）的適（shì）宜（yí）的溶液作為稀釋液、衝洗液（yè）。
如需要，可在上述稀（xī）釋液或衝洗液的滅菌前或滅菌後（hòu）加入（rù）表麵活性劑或中和劑等。
方法驗證試驗
當建立產品的（de）無菌檢查法時，應進（jìn）行方法的驗證，以證明所采（cǎi）用的方法（fǎ）適（shì）合於該產品（pǐn）的（de）無菌檢查。若該產（chǎn）品的組分或原檢驗條件發生（shēng）改變時，檢查方法應重（chóng）新驗證（zhèng）。
驗證時，按"供試品的無菌檢查"的規定及下列（liè）要求進行操作。對每（měi）一試驗菌（jun1）應逐一進（jìn）行驗證。
菌種及菌液製備 同培養基靈敏度（dù）檢查。
薄膜過濾法 取每種培養基規（guī）定接種的供試品總量按薄膜過濾法（fǎ）過濾，衝洗，在最後一次的（de）衝洗液（yè）中加入小於100 cfu的試驗（yàn）菌，過濾。將培養基加至濾筒內。另取一裝（zhuāng）有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察各（gè）濾筒內試（shì）驗菌的生長情況（kuàng）。
直（zhí）接接種法 取符合（hé）直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8 管，分（fèn）別接（jiē）入小於 100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠（lǜ）假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各 2管，取符合直（zhí）接接種法培養基用量要求的（de）改良馬丁培養基 4管（guǎn），分別接入小於（yú）100 cfu的白（bái）色（sè）念珠菌、黑曲黴各 2管。其中1管接入每支培養基規定量的供試品量，另 1管作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察（chá）各濾筒（tǒng）內試驗菌的生長情況。
結果判斷（duàn） 與對（duì）照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試（shì）品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其（qí）抑菌作用可以忽略不計（jì），照此檢查方法和檢查條件進行供試（shì）品的無菌檢查。如含供試品的（de）任一容（róng）器中（zhōng）的試驗菌生長微弱、緩慢或不（bú）生長（zhǎng），則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有（yǒu）抑菌作用，可采用增加衝洗量（liàng）、增（zēng）加（jiā）培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更（gèng）換濾膜品種（zhǒng）等方法，消除供試品的抑菌作用，並重新進行方法驗證試（shì）驗。
驗證（zhèng）試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。
供試品的無菌檢查（chá）
抽驗數量 是指一次試驗所用供試品最小包裝（zhuāng）容器的數量（支或瓶）。成品每亞批均應進行無菌檢查。除另（lìng）有規定外，原液、半成品及成品按表（biǎo）1規定，上市產品（pǐn）監督檢驗按表2規定。
接種量 是指每個最小包裝的最少取樣量（ml或g）。除另有（yǒu）規定外，接種供試品量（liàng）按表3規定。若采用直接接種法，按接種量要（yào）求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培（péi）養（yǎng）基中（兩種培養（yǎng）基的（de）接種支/瓶數（shù）之比（bǐ）為2：1）；若采用薄膜過濾法，應采用三（sān）聯薄膜（mó）過濾器，其中兩（liǎng）聯加入硫乙醇酸鹽流體培養（yǎng）基，另（lìng）一聯加入改良（liáng）馬丁培養基。隻要供試品特性允許，應將所有（yǒu）容器內的內容物全部過濾。
陽性對照 以金（jīn）黃色葡萄球菌作為（wéi）陽性對照菌。供試（shì）品（pǐn）用量同供試品無菌檢查每份培（péi）養基（jī）接種的樣品量。陽（yáng）性對照試驗的菌液製備同培養基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌（jun1）液製備方法，加菌量小於 100cfu。陽性對照也可在供試品無菌檢查培養14天後，取其中一份硫乙醇酸鹽流體培（péi）養（yǎng）基（jī），加入小於 100cfu陽性對照菌，作為陽性對照。陽性（xìng）對照置30℃～35℃培養 48小時～72小時應生長良好（hǎo）。
陰性對照 供試品（pǐn）無菌檢查時，應取相應溶劑（jì）、稀釋液和衝洗液同法操作，作為陰性對照。陰（yīn）性對照不（bú）得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使用表麵活性劑、滅活劑、中和劑（jì）等試劑，應證明其有效性，且對微生物生（shēng）長無毒性。
無菌檢查法包括薄（báo）膜過（guò）濾法和直接接種（zhǒng）法。隻要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品的無菌檢查所采用的檢（jiǎn）查方法（fǎ）和檢驗條件應與驗證的（de）方法相（xiàng）同。
操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表麵（miàn）進行徹底（dǐ）消（xiāo）毒，如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（cái）（如帶有除菌過濾器的針頭（tóu））向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。
供試品處理（lǐ）及接種培養基
除另有規定（dìng）外，按下列方法進（jìn）行。
1.薄膜過濾法
采用封閉式薄膜過濾器，濾（lǜ）膜孔徑應不大於 0.45μm，直徑約為 50mm。根據供試品及（jí）其溶劑的特性選擇濾膜材（cái）質。使用時，應保證濾膜在過濾前（qián）後的完（wán）整性。
水溶性供試液過濾前先將少量（liàng）的衝洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分幹燥。為發揮濾膜的最大過濾（lǜ）效率，應注意保持供試（shì）品溶液及衝洗液（yè）覆蓋整個濾膜表麵。供試液（yè）經（jīng）薄膜過濾後，若需要用衝洗液（yè）衝洗濾膜，每張濾膜每（měi）次衝洗量一般為100ml，總（zǒng）衝洗（xǐ）量不得超過1000ml，以（yǐ）避免濾膜上的微生物（wù）受損傷。
水溶液供試品（pǐn） 取規定量，裝量小於10ml者，全（quán）部轉移至含適宜稀釋液300ml的無（wú）菌容器內（nèi），混勻，立即過濾；裝量為10ml及以上者直接（jiē）過濾，或全部轉移至含適量（liàng）稀釋液的（de）無菌容器內（nèi），混勻，立即過濾。如供試品具有抑（yì）菌作（zuò）用或含防腐（fǔ）劑，須用衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於（yú）三次，所用的衝洗量（liàng）、衝洗方（fāng）法同方（fāng）法驗證試驗。衝洗後，兩個濾器中（zhōng）加（jiā）入硫乙醇酸鹽流體培養基各100ml，另一濾器（qì）中加入改良馬（mǎ）丁培養基100ml。
水溶性固體供試品 取規定量，加（jiā）適（shì）宜的稀釋（shì）液溶解（jiě）或按（àn）標簽說明複溶，然後照水溶液供試品項下的方法操作。
非水溶性供試品 取規定量，混合溶（róng）於含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液300ml的無菌（jun1）容（róng）器內，充分混合，立即過濾。用（yòng）含0.1%～1%聚山梨酯80的衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數（shù）一般不少於三次。加入含或不含聚山梨（lí）酯80的培養（yǎng）基。其他照水溶液供（gòng）試品項下的方法操作。
可（kě）溶於十四烷酸異丙酯的（de）膏劑和粘（zhān）性油劑供試品 取規定量，混合至適量的（de）無菌十（shí）四烷（wán）酸異丙酯①中，劇（jù）烈振搖，使供試品充分溶（róng）解，如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44℃，趁熱（rè）迅速（sù）過濾。對仍然（rán）無法過濾的（de）供試品，於含有適量（liàng）的無菌十（shí）四烷酸（suān）異丙酯中的供試液中加入不少（shǎo）於100ml的稀釋（shì）液，充分振搖（yáo）萃取，靜置，取下層水相作為供試（shì）液過濾。過濾後濾膜衝洗及加入培養基照非水溶性製劑供試品（pǐn）項下的方法操作。
無菌氣（噴）霧劑供試品 取規定量，將各容器置至少－20℃的冰（bīng）室冷凍約1小時（shí）。以無菌操作迅速在容器上端（duān）鑽一小孔，釋（shì）放（fàng）拋射劑後再無菌開啟容器，並將供試液轉移至（zhì）無菌（jun1）容器中，然後照水（shuǐ）溶液或非水溶性製劑供試品項下的方法操作。
裝有藥物（wù）的注射器（qì）供試品 取規（guī）定（dìng）量，將（jiāng）注射器中的內容物（若需要可吸入（rù）稀釋液或標簽所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適量稀釋液（yè）的無菌容器內，混勻，立（lì）即過（guò）濾。然後按水溶性供試品（pǐn）項下方法操作。
同時應采用直接接種法進行包裝中（zhōng）所配（pèi）帶的無菌針頭的無菌檢查。
注： ①無（wú）菌十四烷酸異丙酯的製備 采用薄膜過濾（lǜ）法過濾除菌。選用（yòng）孔徑為（wéi）0.22μm的脂溶性濾膜(140℃幹熱（rè）滅菌2小（xiǎo）時（shí）)過濾。
2. 直接接種法
直接接種（zhǒng）法適用於（yú）無法用薄（báo）膜過濾法進行無菌檢（jiǎn）查的供（gòng）試品。 取規定量供試品,等量分別接種（zhǒng）至硫乙（yǐ）醇酸鹽流體（tǐ）培養基和改良（liáng）馬丁培養基中（兩種培養基的接種支/瓶數之比為2：1）。除另有（yǒu）規定外，每個容器中培養基的用量（liàng）應符合接種的供試品體積不得大（dà）於培養基體積的 10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於 15ml，改良馬丁培養基每管裝量（liàng）不少於10ml。培養基的（de）用量和高度同方法（fǎ）驗證試驗。
混懸液等非澄清水溶液供試（shì）品（pǐn） 取規定量，等量分別接種至各管培（péi）養基（jī）中。
固體供試品 取規定量，加入適宜的稀釋劑溶解，或按標簽（qiān）說明複溶後，混合，等量分別接種至各（gè）管培養基中。
非水溶性供試品 取規定量，混合（hé），加入適量的聚（jù）山梨酯 80或其（qí）它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳（rǔ）化，等量分別接種至各管培養基（jī）中。或等量（liàng）分別直接（jiē）接種至含聚山（shān）梨酯 80或其它適（shì）宜乳化劑的各管培養基中。
培養及（jí）觀察
將上述接種後的硫乙醇酸鹽流體培（péi）養基平均分成兩份，一份置30℃～35℃培養 14天；另一份與接（jiē）種後的改（gǎi）良馬丁培養基置20℃～25℃培養 14天，培養期（qī）間應逐日觀察並記錄是（shì）否有（yǒu）菌生長。如（rú）在加入供試品後、或在培（péi）養過程中，培養基出現渾濁，培（péi）養 14天後，不能從（cóng）外觀（guān）上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中及營養瓊脂斜（xié）麵（miàn）和改良（liáng）馬丁瓊脂斜麵培養（yǎng）基上，細菌培養（yǎng） 2天（tiān）、真菌培養 3天，觀察接種的同種新（xīn）鮮培養基及營養（yǎng）瓊脂和改良馬丁瓊脂斜麵培養基上是否有菌（jun1）生長（zhǎng）；或取培養液（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時作菌種鑒定。
結果判斷
陽性對照管（guǎn）應生長良好，陰（yīn）性對照管不得（dé）有菌生長（zhǎng）。否則，試驗無效。
若供試品管均澄清（qīng），或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符（fú）合規定；若供試（shì）品管中任何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無（wú）效（xiào），即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個（gè）條件時方可判試驗結果無效：
⑴ 無菌檢查試驗所用（yòng）的設備及環境的微生物（wù）監控結果不符合無菌檢查法的要求。
⑵ 回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物汙染的因素。
⑶ 供試品管中生長的微生物經鑒定後，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技（jì）術不當（dāng）引起的。
試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新（xīn）取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判（pàn）供（gòng）試品（pǐn）符（fú）合規定；若有菌生長，判（pàn）供試品不符合規定。
表1 出（chū）廠製（zhì）品不同規（guī）格及原液和半成品最少抽驗數量
供試品
批產量(N)；裝量（V）
最少抽驗數量
注射劑
N≤100
5個
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
凍幹血液製品（pǐn）
V＞5ml
每櫃凍幹N≤200個
5個
每櫃（guì）凍（dòng）幹N＞200個
10個
V≤5ml
N≤100
5個
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
原液或半成品
每個容器取樣，取樣量為每個容器製品總量的0.1%或不少於10ml。每開瓶一次，應如上法抽驗。體外（wài）用診斷製品半成品每
批抽驗量應不少於3ml。
表2上市（shì）製品（pǐn）監督抽驗數（shù）量
品種及裝量（V）
最少抽驗數量
血液製品 V＜50ml
6個（gè）
V≥50ml
2個
其他生物製品
10個
表3 不同規格製品的最少接種量
規格
每支（zhī）（瓶）供（gòng）試品的最少接種量
液體製劑（ml） ≤1
全量
1＜V≤5
半量
5＜V＜20
2ml
20≤V＜50
10ml
V≥50
半量
原（yuán）液或半成品
半量
固體（tǐ）製劑 ＜50mg
全量
50mg≤M＜300mg
半量
300mg≤M＜5g
150mg
M≥5g
半量（liàng）
售前谘詢（xún）