上（shàng）海秉越電子儀器有限公司

1.有機物中的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4
反應式為
2NH2 H2S04 2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化劑）
2.在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放（fàng）出NH3，收集（jí）於H3BO3溶液（yè）中
反應式為:
（NH4）2SO4 2NaOH＝2NH3 2H2O Na2SO4
2NH3 4H3BO3＝（NH4）2B4O7 5H2O
3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根據HCI消耗的量計算（suàn）出氮的含量，然後乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量點焊機
反（fǎn）應式為：
（NH4）2B4O7 H2SO4 5H2O＝（NH4）2SO4 4H3BO3（NH4）2B4O7 2HCl 5H2O＝2NH4Cl 4H3BO3

凱氏定氮儀操作（zuò）步驟：（一）消化1、準備6個凱氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當濃（nóng）度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸（jǐng）上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑（jì）中可能含有的微（wēi）量（liàng）含氮物質，對樣品測定進行校正。4、5、6號燒（shāo）瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其餘所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接（jiē）好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內物質炭化變黑，並產生（shēng）大量泡沫，務必注意防（fáng）止氣泡衝出管口。待泡沫消失（shī）停止產生後，加大火力，保持瓶內液體（tǐ）微（wēi）沸，至溶液澄清後，再繼續加熱使（shǐ）消化液微沸15min。在消化過程中要隨（suí）時轉動燒瓶，以使內壁粘著物質均能流入底（dǐ）部，以保證樣品完（wán）全消化。消（xiāo）化時放出的氣體內含SO2，具（jù）有強烈刺激性，因此自始（shǐ）自終應打開抽水泵將氣（qì）體抽（chōu）入自來水排出。整（zhěng）個（gè）消化過程均應在通風櫥中進行。消化完全後，關閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。（二）蒸餾（liú）和（hé）吸收蒸餾和吸收是在微（wēi）量凱氏定氮儀內進行的。

凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上（shàng）都由蒸氣發生、氨的蒸餾和氨的吸收三部（bù）分組成。

1、儀器（qì）的洗滌儀器安裝前，各部件需經一般方法洗滌幹淨，所用橡皮（pí）管、塞須（xū）浸在10%NaOH溶液中，煮（zhǔ）約10min，水洗、水（shuǐ）煮10min，再水洗數（shù）次，然後安裝並固定在一（yī）隻鐵架台上。儀器使用前，微（wēi）量全部管道都須經水蒸氣洗滌，以除去管道內（nèi）可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌（dí）5min即可。較長時間未使用的儀器，重複蒸氣洗滌，不得少於三（sān）次，並檢查儀器是（shì）否正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。首先在蒸氣發生器中加約2/3體積蒸餾水，加入數滴硫酸使其保持酸性，以避（bì）免水中的氨被蒸出而影響結果，並放入少許沸石（或毛（máo）細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入（rù）蒸餾水約20mL讓水經插管流（liú）入反應室，但玻杯內（nèi）的水（shuǐ）不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發生後，立即關閉廢液排放管上的開關，使（shǐ）蒸氣隻能進入反應室（shì），導致反應室內的水迅速沸騰，蒸出蒸氣（qì）由反應室上（shàng）端口通過定氮球進入冷（lěng）凝管冷卻，在冷凝（níng）管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發燙（tàng）開始計時，連續蒸煮5min，然後移開煤氣燈（dēng）。衝洗完畢，夾緊蒸氣發生器（qì）與（yǔ）收集器之（zhī）間的連接橡膠管，由於氣體（tǐ）冷卻壓力降低，反應室內廢液自動抽到反應室外殼（ké）中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下換放一個盛有硼酸（suān）-指示（shì）劑（jì）混合（hé）液（yè）的錐形瓶（píng）使冷凝管下口完全浸沒在溶（róng）液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶（píng）內的溶液是否變色。如不變色，表示蒸（zhēng）餾裝置（zhì）內部已洗（xǐ）幹淨。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水（shuǐ）衝洗冷凝器下口，關閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。

2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收由於定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術，初（chū）學（xué）者宜先（xiān）用無機氮標準（zhǔn）樣品進行反複練習，再進行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃（nóng）度的標準硫酸銨測試三（sān）次。取潔淨的100mL錐形瓶五隻，依次加入2%硼酸（suān）溶液20mL，次甲（jiǎ）基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴（dī），蓋（gài）好瓶口待用。取其（qí）中（zhōng）一隻錐形瓶承接在冷凝管下端，並使冷凝管的出口浸沒（méi）在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞（sāi），以免錐形瓶內（nèi）液體倒吸。準確吸取2mL硫酸銨（ǎn）標準液加到玻杯中（zhōng），小心（xīn）提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸（zhēng）餾瓶中（zhōng），用少量蒸餾（liú）水衝洗小玻杯3次，一並放人蒸（zhēng）餾瓶中。然後用量筒向小玻（bō）杯（bēi）中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻（bō）塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流（liú）入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關閉收集器活塞，加熱（rè）蒸（zhēng）氣發生器，進行蒸餾。錐形瓶中的（de）硼酸（suān）-指示劑混合液由於吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自（zì）變色時起，再蒸餾3～5min，移動錐形瓶使瓶內液麵離開（kāi）冷凝管下口約lcm，並用少量蒸餾水衝洗冷凝管下口，再繼續蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準備滴定。在一次蒸餾完畢後，移（yí）去煤氣燈，夾緊蒸氣發生器與（yǔ）收集器間（jiān）的橡膠管，排除反應完畢的廢液（yè），用水衝洗小玻杯幾次，並將廢液排除。如此反複衝洗幹淨後，即可進行（háng）下一個樣品的蒸餾。按以上方（fāng）法用標準硫酸銨再（zài）做兩次。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進行（háng）空白測（cè）定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。

3、未知樣品（pǐn）及空白的蒸餾吸收將（jiāng）消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸（zhēng）餾（liú）吸收。加（jiā）5mL熱（rè）的蒸（zhēng）餾水至消化好的樣品或（huò）空白對照液（yè）中，通過小玻杯加到反應室中，再用熱蒸餾水（shuǐ）洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一並倒入反（fǎn）應室內。其餘操作按標準硫酸銨的蒸餾進（jìn）行。由於消化液（yè）內（nèi）硫（liú）酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒（shāo）瓶內（nèi）倒出，必須加入熱蒸餾（liú）水5 mL稀釋之，如果有（yǒu）結晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流（liú）入反應室。此外，還應當注意趁儀（yí）器洗滌尚未完全冷卻時立即加入（rù）樣品或（huò）空（kōng）白對照液（yè），否則消（xiāo）化液通過冷卻的管道容易析（xī）出結晶，造成堵（dǔ）塞。（三（sān））凱氏定氮儀滴定樣品和空白蒸（zhēng）餾完（wán）畢後，一起進行滴定（dìng）。打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內（nèi）溶液呈暗灰色時，用（yòng）蒸餾（liú）水將錐形（xíng）瓶內壁四周淋洗一次。若振搖後複現綠色，應再小心滴（dī）入標準鹽酸溶液半滴（dī），振搖觀察瓶內溶液顏色變化，暗灰色在一二（èr）分鍾內不變，當視為到達滴定終點。若呈粉紅色，表（biǎo）明已超越滴定終點，可在已滴定耗用的標準（zhǔn）鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白對照液接受瓶內的溶液（yè）顏色不變或略有變化（huà）尚未出（chū）現綠（lǜ）色，可以不滴定（dìng）。記錄每次滴定耗用標準鹽（yán）酸溶液（yè）毫升數，供（gòng）計算用。